PCR扩增的步骤

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

模板DNA的变性

模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

模板DNA与引 物的退火(复性)

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

引物的延伸

DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基李卖宴配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中配答模板的拷贝。

PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%， 但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素。大多数情哪银况下，平台期的到来是不可避免的。

PCR扩增是以单链DNA为模板，4种脱氧核糖核苷酸为底物，在模板末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。反应时先溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态然后降低哪胡溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火再将温度升至合适温度，在热稳定DNA聚合酶的催化下，以脱氧核糖核苷酸为原料，引物沿DNA模板延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此橡做重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸李如拦组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成:模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成。

PCR即聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）的缩写，它是体外酶促合成特异DNA片段的方法。这一灶蠢消方法的要点是合成两个分别互补于待扩增DNA片段隐知两端的小片段引物，在含有引物、待扩增DNA模板核苷酸底物和DNA多聚酶的反应体系中DNA复制反复进行，在短时间内可以取得大量扩增产物。其原理是寡聚核苷酸链引物在DNA聚合酶的作用下沿模板延伸，合成两个与靶DNA两侧序列互补的引物，在体外进行靶DNA的重复合成。

主要的技术步骤是：

（1）DNA变性 加热使靶DNA序列双链解离成单链DNA。

（2）引物与靶DNA退火 适当降低温度，使两个引物分别结合成靶DNA两条的3′末端向5′末端延伸。

（3）引物延伸 在DNA聚合酶的催化下，引物档罩沿着靶DNA3′末端向5′末端延伸。新合成的DNA链在变性解离后，又可作为模板与引物杂交，并且在DNA聚合酶的催化下，引导合成新的靶DNA链。如此反复进行以上3个步骤，即可使靶DNA片段指数性扩增。

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