质粒 标签插入方法

质粒标签插入方法：gst能有效增加蛋白溶解度用于纯化，同时可以用标签抗体检测融合蛋白，设计标签的位置要根据蛋白构想来，不影响你的蛋白功能，活性位点 N端信号肽等等。

为了鉴别质粒中是否含有插入片段，对一些载体进行了工程改造，这样产生的多位点接头的分离会引起可见的表型。例如：lacZ基因的应用（多位点接头的分离会引用白细胞的生长而抑制蓝细胞的生长，如pU19）和cccdB基因（调控细胞死亡）的应用（分离会促进细胞存活）。

功能：

质粒具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。细菌质粒是DNA重组技术中常用的载体。载体是指把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。

将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体。然后将这种重组体经微生物学的转化技术，转入受体细胞(如大肠杆菌)中，使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达，从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。

在标签蛋白纯化过程中，合适的标签不但有利于蛋白的纯化，促进蛋白的可溶性，同时还不能影响蛋白的结构功能和下游应用。

His-Tag（组氨酸标签）

His-Tag（组氨酸标签）His-Tag 由6-10 个组氨酸残基组成，分子量不到0.84KD，通常插入在目的蛋白的C 末端或N 末端。His-Tag是目前原核表达最常用的标签，蛋白纯化完之后可以不需切除此标签，也不会对蛋白产生功能影响。同时，蛋白纯化步骤简便，纯化条件温和，对蛋白也不会产生太大影响。His-Tag是蛋白纯化的首选标签。

His-Tag 的特点

His-Tag 本身的特性对目的蛋白没有影响，不会形成二聚体；

分子量较小，只有0.84KD，对蛋白的下游应用不会产生影响；

免疫原性低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备 抗体 ；

His-Tag 与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白表达；

可与其他标签构建双标签表达，可用于多种蛋白表达系统，纯化条件温和对蛋白影响较小。

磁珠法纯化His-Tag蛋白的原理

海狸His-tag蛋白纯化磁珠以磁性 琼脂 糖微球为基质，活化偶联亚氨基二乙酸（IDA）,分别螯合镍离子（Nickel）、钴离子（Cobalt）两种金属离子，组氨酸残基侧链与金属离子（镍/钴离子）有强烈吸引力，可通过磁性分离方式直接从生物样品中一步纯化出高纯度的目标蛋白，海狸His-Tag蛋白纯化磁珠纯化后的蛋白纯度高于85%。

GST-Tag（谷胱甘肽巯基 转移酶 标签）

GST-Tag（谷胱甘肽巯基转移酶标签）GST-Tag 相对分子质量较大，约为26KD，插入在目的蛋白的C 末端或N 末端，大肠杆菌中常用在N 端。GST(谷胱甘肽巯基转移酶) 蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶。一般选择GST 标签的目的有两个，一是提高蛋白表达的可溶性，二是提高蛋白的表达量。蛋白表达纯化结束后需根据不同的蛋白应用而确定是否切除标签，标签较大，切除与否需根据下游应用考虑。如果要去除GST 融合部分，可用位点特异性 蛋白酶 切除。检测方法可用GST 抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。

GST-Tag 的特点

增加外源蛋白的可溶性；可在不同的宿主中表达，适用范围广；

可用不同的蛋白酶方便去除；

很好保留了蛋白的 抗原 性和生物活性，提高外原蛋白的稳定性；

高特异性，纯化方便且温和；

分子量较大，可能会影响 蛋白质 的功能和下游实验；

如果蛋白不可溶，很难用变性的方法纯化。

磁珠法纯化GST-Tag蛋白的原理

海狸GST融合蛋白纯化磁珠，通过磁珠偶联谷胱甘肽(GSH)，利用谷胱甘肽与谷胱甘肽巯基转移酶之间酶和底物的特异性作用力，分离出带有GST标签的蛋白，纯化蛋白的纯度达到90%。

包涵体的形成是一个由许多蛋白质参与的极端复杂的动力学过程，依赖于蛋白质的折叠速率和聚集速率，并且与蛋白质的合成和降解程度相关。强的表达系统，高的诱导剂浓度，相对较高的培养温度常常造成包涵体的形成。除了外界因素，包涵体的形成依赖于蛋白质特异的折叠行为，而不是蛋白的通常特性，如大小，融合标签，相对的疏水性。尽管如此，限制折叠速率的结构特性，如二硫键的形成常常是含有二硫键蛋白质正确折叠的限速步骤（并不绝对，因为有些蛋白质二硫键的破坏并不影响其功能），富含二硫键的蛋白质具有更为复杂的结构，当高

水平表达时，由于大肠杆菌细胞质是一个偏还原性的环境，蛋白质容易形成错配的二硫键，

这常常是包涵体形成的主要原因。膜蛋白具有暴露的疏水区，表达时易于聚集形成包涵体，也有可能由于降解或对细胞的毒性作用使得表达水平极低。蛋白质的糖基化可以影响到蛋白质的折叠行为和溶解性，当它们在原核系统进行表达时，也容易聚集。

防止包涵体常用的方法：

使用中等强度或弱的启动子，低温培养，有限的诱导，优化培养基条件，进行融合表达，

与伴侣分子和折叠酶共表达，表达定位于不同的空间，选择突变的菌株或其他的原核表达系统。

增加蛋白质折叠的添加剂：

添加剂

可能的作用机制

甘油

对蛋白质具有优先的水合作用

/增加黏度L-精氨酸两亲分子/

渗压剂甘氨酰甜菜碱

/

山梨糖醇  对蛋白质具有优先的水合作用

阿拉伯聚糖   增加黏度

木糖醇  增加黏度

乙醇   调节极性

DMSO     调节极性

两性离子表面活性剂（Zwitterionic detergents）

保护非极性表面Triton X-100保护非极性表面硫代甜菜碱类物质（NDSBs）保护非极性表面蔗糖/海藻糖对蛋白质具有优先的水合作用/增加黏度N-氧化三甲胺（TMAO）对蛋白质具有优先的水合作用/渗压剂三氟乙醇（TFE）促进二级结构的形成低浓度盐酸胍使部分折叠的中间体不稳定/增加天然构象蛋白质的溶解性低浓度尿素使部分折叠的中间体不稳定/增加天然构象蛋白质的溶解性配体稳定天然结构状态聚乙二醇保护熔球体（molten globule）/增加黏度需要强调的是在培养细菌时，在培养基中加入5％的乙醇可以起到一定的防止包涵体产生的作用。

对比另外一篇文章：

减少包涵体形成的策略

降低重组菌的生长温度，降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。

2. 添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl。

3. 供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。

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